槲皮素葡萄糖醛酸对 ALDH2 的抑制提出了解释红酒头痛的新假设

喝红酒会引起一些受试者的头痛，但他们喝其他酒精饮料却不会感到头痛。造成这种效应的原因有多种，通常是红酒中高含量的酚类物质，但具体机制尚不清楚。一些饮酒者会出现脸红和头痛，这是由于 ALDH2 变异体功能失调造成的，ALDH2 是一种代谢乙醛的酶，导致乙醛积聚。红葡萄酒中槲皮素及其苷的含量比白葡萄酒或其他酒精饮料高得多。我们发现 quercetin-3-glucuronide（一种典型的循环槲皮素代谢物）可抑制 ALDH2，IC 50为 9.6 µM。据报道，红酒的消费量导致了流通中的类似水平。因此，我们提出，从红酒中各种形式的槲皮素中提取的槲皮素-3-葡萄糖苷酸可以抑制 ALDH2，导致乙醛水平升高，并随后在易感受试者中出现头痛。需要进行人体测试来检验这一假设。

介绍

头痛是一种常见的疾病，每天影响世界上约 16% 的人口1。主要头痛为原发性头痛，即紧张型头痛、丛集性头痛、偏头痛。头痛，特别是偏头痛发作，是导致残疾的重要原因。偏头痛仍然是世界上第二大致残原因，也是年轻女性的第一大致残原因2。

酒精饮料（啤酒、葡萄酒、烈酒）是最常见的与头痛相关的饮食因素，至少有 37% 的患者偶尔会引发头痛3 , 4。根据国际头痛协会 (IHS) 的数据，酒精饮料与两种类型的酒精引起的头痛有关。首次头痛、即刻头痛或原发性头痛（国际头痛疾病分类 [ICHD]-III 的 8.1.4.1）在饮酒后 3 小时内开始，并在停止饮酒后 72 小时内缓解。其次，迟发性酒​​精引起的或宿醉性头痛（ICHD-III beta 的 8.1.4.2）在饮酒后 5-12 小时内发生，并在 72 小时内缓解4 , 5。

众所周知，大量饮酒会引起头痛。酒精引起的头痛有多种归因方式，即酒精的直接影响、酒精的代谢、基因组成和同类物的存在6。酒精在肝脏中通过两步过程代谢为乙酸：酒精（乙醇）通过乙醇脱氢酶（ADH）转化为乙醛，然后通过乙醛脱氢酶（ALDH）将乙醛转化为乙酸。在较高的乙醇浓度下，乙醇快速转化，导致乙醛积聚。乙醛浓度较高时会产生不良反应，例如恶心、出汗、面部潮红和头痛6 , 7。事实上，诸如双硫仑之类的药物会抑制乙醛脱氢酶 (ALDH)，并且在饮酒时会导致乙醛积聚，因此可通过引起上述不适（包括头痛 8）来治疗酗酒，从而阻止饮酒。ALDH 酶有多种亚型，因此对底物具有不同的亲和力。细胞质 ALDH1 和线粒体 ALDH2 亚型在乙醛代谢为乙酸的过程中最为重要。对于乙醛， ALDH1 的 K m较低（约 30 µM），而 ALDH2 的 K m高（0.2 µM）。因此，ALDH2 可以快速消除乙醛，使血液中的乙醛浓度维持在 3 µM 或更低，大约比肝脏中的水平低 1000 倍9。ALDH2 酶有两种亚型：ALDH21（在世界上大多数人口中最常见）和功能失调的变体 ALDH22（大约为 100 倍）。40% 的东亚人，包括汉族、日本人和韩国人10。ALDH22 纯合子中不表现出 ALDH2 活性，而杂合子则报告该酶的活性降低。大多数将亚洲人低度酒精中毒与 ALDH22 相关的研究报告称，饮酒后血液乙醛浓度显着升高（30 至 75 µM 或更高，比正常水平高 10 倍）9 , 10 , 11 , 12。这种高水平的乙醛会导致面部潮红、头痛、心动过速和恶心，类似于双硫仑治疗9。这两种情况与乙醛积累之间的相似性表明乙醛积累与酒精饮料引起的头痛之间存在关系。

在一项关于原发性头痛中酒精使用障碍 (AUD) 的荟萃分析综述中，28% 的研究认可红酒为触发因素，其次是烈酒 (14%)、白葡萄酒 (10%) 和起泡酒/啤酒 (10%) ）13．红酒头痛（RWH）不需要过量的葡萄酒作为触发因素。大多数情况下，头痛是在仅喝一两杯酒后 30 分钟至 3 小时内诱发的3。据报道，生物胺、亚硫酸盐、酚类黄酮类或单宁等葡萄酒成分可能是葡萄酒头痛的原因3 , 4 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18。然而，目前还没有明确的化学成分是红酒头痛（RWH）的主要诱因，也没有提出引发头痛的机制。

红葡萄酒中的酚类化合物（尤其是类黄酮）含量较高，是白葡萄酒的十倍，使其成为 RWH 16的主要竞争者。然而，酚类物质和高酚类食物与头痛无关。有趣的是，据报道，一些红酒酚类物质（例如槲皮素和白藜芦醇）会影响 ALDH 19 , 20的活性。据报道，槲皮素在低浓度 (< 1 mM) 乙醛和辅因子 NAD+ 19下是胞质乙醛脱氢酶 (ALDH1) 的有效抑制剂。然而，这些研究的目的是将 ALDH 的活性与抗癌特性和出生缺陷19、21联系起来，而不是与乙醛代谢联系起来。此外，上述研究均未报道槲皮素对线粒体乙醛脱氢酶 (ALDH2) 的影响。Keung 和 Vallee 22的一项研究报告了包括槲皮素在内的几种黄酮类化合物对 ALDH1 和 ALDH2 活性的影响。他们发现槲皮素和其他红酒类黄酮（山奈酚、芦丁和杨梅素）对两种醛脱氢酶没有影响。但该研究中的酶测定是在 pH 9.5 下进行的，因此在生理 pH 下意义不大。Orozco 等人的另一项研究中。23报道了红酒发酵过程中槲皮素对酵母细胞质和线粒体 ALDH 的抑制作用。因此，评估红酒类黄酮对 ALDH2 活性的影响以及对乙醛代谢的可能影响可能为 RWH 提供线索。

为了评估 RWH 的这种可能机制，我们使用体外酶测定评估了红酒黄酮类化合物（尤其是槲皮素衍生物）对线粒体 ALDH2 的抑制作用。

结果

红酒酚类/黄酮类化合物对 ALDH2 的体外抑制作用

体外评估了所选葡萄酒酚类/黄酮类化合物（浓度为20μM）对ALDH2的抑制作用（以%计，表1）。在所选化合物中，槲皮素葡萄糖醛酸苷（化合物9）（槲皮素的肝脏代谢物）显示出最高的抑制活性（78.69±1.21％），而表儿茶素的抑制活性最低（0.34±0.12％）。对于所有其他化合物（1-8、10-12），抑制活性范围为 14.77 ± 0.39 至 27.69 ± 0.61%，表明葡萄酒类黄酮对 ALDH2 具有低至中度的抑制作用。

此外，据观察，糖基化形式的槲皮素（化合物 3-7）表现出比糖苷配基（化合物 1-2）更低的抑制活性。然而，与槲皮素相比，甲氧基化槲皮素，tamarixetin 并没有差异性地抑制该酶。

根据抑制筛选试验，槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷被选为有效的抑制剂，用于进一步研究。不同浓度的槲皮素-3-葡萄糖醛酸（5-20​​ µM）对 ALDH2 的抑制如图 1所示。Quercetin-3-glucuronide 的 IC 50为 9.62 µM，对 ALDH2 的抑制作用比苷元槲皮素（IC 50为 26.50 µM）更强。然而，槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷的抑制作用低于临床上用于抑制该酶的药物双硫仑（IC 50为 1.45 µM，数据未显示）。

不同浓度的槲皮素-3-葡萄糖苷酸和槲皮素对 ALDH2 的抑制作用。

讨论与结论

黄酮醇，如槲皮素、杨梅素和山奈酚，以糖苷或苷元的形式存在于葡萄酒中。在两项研究中，白葡萄酒中的总黄酮醇含量（平均值：痕量至 7 mg/L）几乎比红葡萄酒（平均值：4-93 mg/L）低十倍24 , 25。伯恩斯等人。26报道了来自不同葡萄酒国家、品种和酿造方法的 16 种红葡萄酒中总槲皮素和游离槲皮素的含量分别为 5 至 104.7 微摩尔和 1.8-41.9 微摩尔。许多其他研究报告了意大利27、28、澳大利亚24、西班牙29和保加利亚30葡萄酒中槲皮素的含量。从报告中可以明显看出，红酒中的槲皮素含量存在差异，并且大多数调查评估的样品数量相对较少（n < 20）。

据报道，红酒中的槲皮素-3-葡萄糖苷酸是主要的槲皮素苷之一24 , 31 , 32。卡斯蒂略-穆尼奥斯等人。32发现不同葡萄品种的红葡萄酒中槲皮素 3 葡萄糖醛酸含量在 10.26 至 13.81 毫克/升之间。吉塞利等人。31观察到意大利桑娇维塞葡萄酒中含有 19 毫克/升的槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷。杰弗里等人。24发现槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷是 121 种澳大利亚红酒中主要且最稳定的糖苷，其含量范围从低于检测水平到 39.67 mg/L。

研究多次指出，暴露在阳光下的葡萄串中槲皮素的含量比阴影中的葡萄串高 4 至8倍33、34。Ritchey 和 Waterhouse 35评估了大批量与超优质商业赤霞珠葡萄酒中的槲皮素总含量。超优质葡萄酒的平均总黄酮醇含量（202 毫克/升）是大容量葡萄酒（53 毫克/升）的四倍。该研究解释说，在生产超优质葡萄酒的地区，葡萄园的做法（棚架葡萄藤、间苗、去除叶子）会导致更多的阳光照射，从而提高槲皮素的产量。但是，水平的变化不仅源于阳光照射引起的葡萄成分差异，还源于酿酒技术，包括发酵过程中的皮肤接触、稳定/澄清程序和陈酿方法26。人类和哺乳动物胃肠道中槲皮素的吸收途径已广为人知36。大多数槲皮素吸收发生在小肠中，少量在胃中吸收36。吸收后血浆中未发现槲皮素苷元和糖苷。在血浆中，它以缀合物形式出现 (78–79%)，包括槲皮素-3-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-硫酸盐和甲基化形式，例如罗望子素 (10–13%) 和异鼠李素 (8.5 至 11%) 36 , 37。关于食物和食物提取物（洋葱、黑醋栗、越橘、苹果、红葡萄、西红柿）、饮料（茶、果汁、咖啡、可可和葡萄酒）和溶液形式补充剂中槲皮素生物利用度的大量研究报道、粉末、胶囊或片剂36。通常在血液和尿液中测量槲皮素衍生物或分解代谢物以评估其生物利用度。德弗里斯等人。38比较了 12 名健康男性中 750 mL 红酒（47.0 µmole 槲皮素）、50 g 炸洋葱（52.6 µmole 槲皮素）和 375 mL 红茶（45.3 µmole 槲皮素）中黄酮醇的生物利用度。他们观察到，在“剂量”相当的情况下，饮用红酒后血浆槲皮素（包括结合物）水平（0.026 µM）是洋葱（0.053 µM）的一半。研究还发现，人体内血浆槲皮素水平存在 10% 的差异，人与人之间存在 10-20% 的差异。在另一项研究中，Spaak 等人。如图39所示，饮用2杯含有37.7μmole槲皮素的黑皮诺导致血浆总槲皮素浓度为2.74μM。戈德堡等人。40饮用含有 25 mg/70 kg 体重槲皮素苷元剂量的白葡萄酒后，血浆总槲皮素水平为 4.19 µM。血浆中检测到的槲皮素和结合物的总浓度为0.84μM，即槲皮素剂量的26.9%。

因此，假设葡萄酒中槲皮素的报告浓度为 346 µM，则标准葡萄酒饮料 (147 mL) 的槲皮素含量为 50.6 µM。因此，血浆总槲皮素浓度预计约为 6 µM。此外，考虑到血浆中近 80% 的总槲皮素对应于结合槲皮素（主要是槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷），血浆中的水平将为 5 µM。因此，根据我们的研究，一杯含有 5 µM 槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷的标准葡萄酒可抑制近 37% 的 ALDH2。酶的抑制作用会导致葡萄酒中的酒精代谢产生乙醛积累，这可能会导致 RWH，而这种情况在其他含有较高生物利用度槲皮素但不含酒精的食物（例如洋葱）中并不明显。然而，实际的抑制作用会更高或更低，具体取决于其他成分（例如辅因子、缓冲液等）的浓度。这些结果表明，RWH 可能是红酒槲皮素代谢物抑制 ALDH2 的结果。

测试这个假设需要验证。一个明显的实验是将具有不同酚类水平（特别是槲皮素和总黄酮醇）的葡萄酒与摄入后观察到的头痛发生情况进行比较，尽管存在基质差异。控制酒精含量势在必行。另一个更简单的实验是为 RWH 受试者提供槲皮素补充剂或安慰剂和一杯标准伏特加酒，看看是否会导致头痛。

为了在更基本的层面上探讨这个概念，我想到了其他想法。循环中槲皮素-3-葡萄糖醛酸的浓度是多少，可抑制体内 ALDH2，从而产生升高的乙醛水平？这些水平与 RWH 受试者的头痛感知相关吗？在相同浓度下，RWH 敏感受试者是否会经历更大的抑制和更高水平的乙醛？或者，RWH 受试者是否具有 ALDH2 同工型（ALDH21 和 ALDH22）变异的遗传倾向，对乙醛更加敏感，这可能与这些受试者记录的偏头痛倾向有关3。此外，对这些受试者的基因组研究可以阐明这种棘手疾病背后的遗传多态性。

如上所述，市场上各种葡萄酒的槲皮素含量存在很大差异。因此，对大量葡萄酒样品进行更详细的槲皮素水平分析可能有助于指导患有 RWH 的葡萄酒饮用者。但目前的测量技术很复杂，因此，一种简单而快速的黄烷醇或槲皮素检测方法（例如二次光谱方法）可以提供快速的头痛潜力评估。

总之，本研究表明，红酒引起的头痛是由于槲皮素及其苷的存在而引起的，槲皮素及其苷在代谢为槲皮素葡萄糖醛酸苷后，会抑制 ALDH2 酶的活性。同时饮酒时，槲皮素葡萄糖醛酸在体外抑制ALDH2，导致有毒乙醛蓄积，导致头痛。需要对人类受试者进行进一步的研究来验证这一假设。

材料和方法

化学品和试剂

槲皮素、槲皮素二水合物、槲皮素-7-鼠李糖苷、儿茶素和表儿茶素购自美国Sigma-Aldrich。槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷、芦丁(quercetin-3-rutinoside)、tamarixetin(4-O-甲基槲皮素)、槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷、山奈酚和杨梅素购自Extrasynthese ， 法国。所有使用的酚醛树脂纯度均≥ 99%（HPLC 级）。使用来自美国 Sigma Aldrich 的二甲基甲酰胺 (DMF) 作为有机溶剂来制备酚类化合物储备溶液 (10 mM)。

人重组 ALDH2 酶购自美国 Sigma-Aldrich。如制造商的分析证书中所述，酶纯度 > 90%，生物活性 > 0.14 单位/mL。QuantiChrom™乙醛脱氢酶抑制剂筛选试剂盒(EIAL-100)购自美国Thermo-Fischer Scientific BioAssay Systems，用于定量测定酚类化合物对ALDH2活性的抑制作用。

酚类化合物对 ALDH2 抑制的测定

根据制造商的说明，使用 QuantiChrom™ 乙醛脱氢酶抑制剂筛选试剂盒（EIAL-100，BioAssay Systems，美国）测量所选酚类化合物对 ALDH2 的抑制作用。原则上，该试剂盒基于 ALDH 将乙醛酶促转化为乙酸和 NADH。形成的 NADH 又将甲臜试剂还原成有色产物，在 565 nm 处测量的吸光度与反应中酶的活性成正比。简而言之，通过将 0.1 U/mL 的 ALDH2、DMF 中的 20 µM 酚类化合物添加到试剂盒中提供的由测定缓冲液、NAD/MTT、心肌黄酶和 1× 底物组成的反应混合物中，在 96 孔板中进行测定。作为对照，如前所述，将 ALDH2 和不含酚类化合物的溶剂 DMF 添加到反应混合物中。通过添加 0.1 U/mL 的 ALDH2、不含酚类化合物的溶剂 DMF、测定缓冲液、NAD/MTT 和心肌黄酶来制备空白反应。所有反应的最终体积为 100 µL。将反应物在室温下孵育 30 分钟，并在 565 nm 处读取光密度（SpectraMax® iD3，Molecular Devices，美国）。

测试化合物的 ALDH 抑制计算如下：

其中ΔOD测试化合物是测试化合物的OD 565nm值减去空白孔在30分钟时的OD 565nm值。

ΔOD 无抑制剂是对照的 OD 565 nm值减去空白孔在 30 分钟时的 OD 565 nm值。

统计分析

所有分析均一式三份进行，并报告为平均值±标准差。样本中的平均差异通过方差分析 (ANOVA) 进行评估，并使用 SPSS Statistics 29 软件（IBM，美国）使用 Tukey 检验 p < 0.05 进行事后分析。

数据可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇发表的文章中。